听说课程配笔记，学习无压力

Original 刘小泽单细胞天地 2022-06-06

收录于合集 #第一期单细胞视频笔记汇总 21个

课程笔记

粉丝：有单细胞线上课程吗？

小编：什么？我们的单细胞转录组分析线上课程已经上线好久了，你们竟然都不知道吗，每篇推文后面的课程推荐没人看的吗，小编已哭晕在厕所

好了，戏演完了，下面郑重介绍下我们的单细胞线上课程：（详情戳下方链接）

全网第一个单细胞转录组数据分析实战视频教程(预售第二波通知)

课程链接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53

这个课程笔记栏目记录了学员们学习单细胞转录组课程的学习笔记

希望大家能有所收获！

整个课程框架

整个课程分为了5个单元，目前更新了3个单元，其中：

第一单元为背景介绍，包括单细胞转录组近10年的发展历程，以及两大主流技术smart-seq2（力求检测到单个细胞的基因数量）和10x（追求检测到的细胞数量）的介绍；
第二单元加入了常规转录组的分析流程；
第三单元重点利用smart-seq2技术得到的结果，结合三个R包进行分析；未来第4个单元将会整合公共数据库(TCGA、METABRIC)以及文献中的数据集进行整合分析；
最后一部分就是展望，介绍10X的数据分析

蓬勃发展的单细胞转录组

与普通bulk转录组最大的区别就是：普通的是以一群细胞为一个样本，最后得到结果是一个均值，而单细胞将精度提高，将一个细胞作为一个样本，从而可以看出细胞的异质性

目前单细胞领域文章发表量迅速升高，有的团队一年可以出8-9篇CNS，最著名就是北大的汤富酬教授研究发育生物学领域，另外肿瘤、免疫研究相关也十分火热

不管怎样，单细胞转录组数据到了生信工程师手中，即使生物背景知识可能不完全理解，但他确实可以通过数据分析去说明某些事情。

推荐一个网站：https://omictools.com/single-cell-rna-seq-category

首先原始数据产出就有两种主流途径：测更多的细胞(以10X为主打)和测更多的基因(以smart-seq2为主打)；

然后数据就要经过一系列的质控才能开始上游分析，也就是预处理阶段 ，也是两种方法：UMI、ERCC。因为单细胞精度太高，每个细胞都是独特的，和普通的Bulk RNA-seq不同，材料不容易获得，不太好做重复，因此通过生物学重复来评价技术手段/数据质量的方法不靠谱。

UMI即unique molecular identifier，是一段随机序列，每一个DNA分子都有自己的UMI序列。可以大大降低PCR误差（比如：原来两个样本中某基因表达量相同，但是由于两个样本扩增效率不同，样本1为99%，样本2只有95%，那么同时扩增40个循环，这同一个基因就有了0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差异，因此本来没有差异也会因为外界因素扩增效率的影响而产生“假阳性”）；设计不同标签的数量，大大超过待扩增的转录本，产生独特标记的分子，并允许控制扩增偏差【例如10-mer的UMI，就会有 4的十次方 约等于100万种变化】
ERCC就是外源RNA对照联盟开发的人工设计好的已知序列和数量的mRNA，高的ERCC含量与低质量数据相关，并且通常是排除的标准

关于QC的注意点：
QC不是仅仅对于下机的fq数据有效，它要在每一个分析环节都有体现。
主要包括：
一般的diagnostic plots: GC content, adapter, kmer, duplicated, base pair quality
mapping reads/rate
total sequencing reads (library size)
the number of detected genes：检测dropouts，也就是实际有表达却没被检测到的基因
ERCC spike-ins content
the percentage of housekeeping genes, cell cycle genes, highly expressed genes, mitochondrial genes
overall gene expression patterns

质控的表达矩阵要进行归一化，因为不同的细胞有不同特征，另外实验条件也不同；这对于解释单细胞数据是至关重要的。单细胞的样本量相比bulk实在小太多，因此更容易引入技术噪音，这个必须去除；

加入了降维这重要的一步，因为细胞数量太多，也就是要分析的样本数量要几百甚至几千，于是会产生几百或几千的维度(可以试想一下常见的三维、四维空间)；

找差异基因、找marker基因(和差异基因不同，它不需要有差异，只需要有重要的生物学意义)、根据基因重要性进行细胞分群

文献

构建文库

综述：Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. 2017, （doi: 10.1016/j.molcel.2017.01.023.）

涉及到了6中文库构建方法（CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-
seq, Smart-seq, and Smart-seq2），可以再结合相关的每一个文库找6篇文章

文章发现：Smart-seq2可以在每个细胞中找到最多的基因，同样费用比较高；检测少量细胞时，MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq2更有效

归一化

文献1：Assessment of Single Cell RNA-Seq Normalization Methods，2017 (doi: 10.1534/g3.117.040683)

评价了几种归一化方法：

fragments per kilobase of transcript per million mapped
reads (FPKM)(Mortazavi et al., 2008)
upper quartile (UQ)(Bullard et al., 2010)
Trimmed mean of M-values (TMM)(Robinson and Oshlack, 2010)
DESeq(Love et al.,2014)
removed unwanted variation (RUV)(Risso et al., 2014)
gamma regression model (GRM)(Ding et al., 2015).

文献2：Performance Assessment and Selection of Normalization Procedures for Single-Cell RNA-Seq, 2019 (DOI:https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.010)

主要研究了scone方法：a flexible framework for assessing performance based
on a comprehensive panel of data-driven metrics

(http://bioconductor.org/packages/scone/)

另外方法还有很多，比如：LSF(Lun Sum Factors)，BigNorm, Scnorm, BASiCS, RLE(size factor relative log expression)

降维

PDF: https://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/349/740/RUG01-002349740_2017_0001_AC.pdf 值得好好阅读，讲了许多关于降维原理和应用的知识

文中1.5.1部分（Clustering high-dimension to identify subtypes）写出：

Importantly, the reduced dimensionality data are less noisy than the high-dimensional data bust lose some of the biological variance.

文章1：PCA, MDS, k-means, Hierarchical clustering and heatmap.

文章2：Outlier Preservation by Dimensionality Reduction Techniques
"MDS best choice for preserving outliers, PCA for variance, & T-SNE for clusters"

鉴定细胞群

每个术语都对应一篇文献

降维：PCA、tSNE、DM(Diffusion maps)
feature selection：M3Drop(Michaelis-Menten Modelling of Dropouts)、HVG(Highly variable genes)、Spike-in based methods、Correalated expression
Seurat：is an R package designed for the analysis and visualization of single cell RNA-seq data. It contains easy-to-use implementations of commonly used analytical techniques, including the identification of highly variable genes, dimensionality reduction (PCA, ICA, t-SNE), standard unsupervised clustering algorithms (density clustering, hierarchical clustering, k-means), and the discovery of differentially expressed genes and markers.
SC3：SC3 achieves high accuracy and robustness by consistently integrating different clustering solutions through a consensus approach. Tests on twelve published datasets show that SC3 outperforms five existing methods while remaining scalable, as shown by the analysis of a large dataset containing 44,808 cells. Moreover, an interactive graphical implementation makes SC3 accessible to a wide audience of users, and SC3 aids biological interpretation by identifying marker genes, differentially expressed genes and outlier cells.
tSNE+kmeans
SNN-Clip: doi: 10.1093/bioinformatics/btv088
SINCERA: SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.

综述：A systematic performance evaluation of clustering methods for single-cell RNA-seq data (SC3 and Seurat show the most favorable results)